电子束光刻法合成的巨噬细胞相容磁性纳米机器人

材料

AR-N 7520 电子束抗蚀剂和 AR 300-46 Development 购自 Allresist（德国）。 胎牛血清 (FBS)、Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)、RPMI-1640 培养基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和青霉素-链霉素购自 Biological Industries (Kibuts Beit Haymek, Israel)。 细胞计数试剂盒 8 (CCK8) 购自 MedChemExpress (USA)。 TRITC 鬼笔环肽和 DAPI 购自索莱达宝科技有限公司。 （中国北京）。 小鼠L929成纤维细胞、RAW 264.7巨噬细胞、HepG2肝细胞癌细胞均购自中国科学院细胞库。

制造纳米机器人

纳米机器人的制造过程如图 1 所示。首先，以 6 Å/sec 的沉积速度在硅晶片上蒸发 30 nm 铝 (Al) 层。 然后，以 3000 rpm 的涂布速度通过旋涂沉积 100 nm 的电子束抗蚀剂层 (AR-N 7520.07)，然后在 95°C 下烘烤 3 分钟。 然后，将样品暴露于曝光测量为 750 u/cm 的电子束曝光单元² 创建 L 形图案，如图 1a 所示。 然后，通过电感耦合等离子体蚀刻在 300 W 下 20 s 显影样品，以去除具有 EB 阻抗的多余未保护 Al，如图 1b 所示。 最后，通过电子束蒸发（EBE）在样品上涂覆 20 nm 银（Ag）、70 nm 镍（Ni）和 10 nm 钛（Ti）层，如图 1c 所示； 这三种材料的涂层速度分别为 4 Å/s、6 Å/s 和 6 Å/s。

将样品置于氢氧化钠 (NaOH) 和过氧化氢 (H.) 的混合溶液中。₂一个₂) 在 65°C 下 5 分钟解冻胎体层，如图 1d 所示。 H. 作品₂一个₂ 它会在加热下分解产生气泡，将纳米机器人推离基板，使纳米机器人在释放后分散在溶液中。 在浸入 NaOH 和 H 之前观察纳米机器人。₂一个₂，浸泡10分钟后，浸泡20分钟后，分别如图2a-c所示。 观察到纳米机器人在浸泡20分钟后完全释放并分散在溶液中而没有聚集，如图2c所示。

细胞培养

细胞培养物保持在 37°C、5% CO₂. 小鼠成纤维细胞 L929 和 RAW 264.7 巨噬细胞在补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 中培养。 HepG2肝细胞癌细胞在补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养。 每 48 小时更换一次培养基，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 将细胞传代，在 37 °C 下孵育 1 分钟。

细胞毒性评估

使用 CCK-8 测定法确定细胞毒性。 通过在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟对样品进行灭菌。 以 2 x 10的密度悬浮细胞⁴ 每毫升的细胞接种在样品上。 根据以下步骤在不同时间点测量细胞细胞毒性。 用 PBS 清洗与样品一起孵育的细胞，然后加入含有 10% CCK-8 的新鲜完全 DMEM 培养基。 2 h 后，取各样品 100 μl 溶液转移至 96 孔培养板中，用酶标仪（Tecan）测定 450 nm 处的吸光度。

通过 SEM 和免疫荧光检测细胞形态

将细胞暴露于 48 孔细胞培养板中的样品。 24小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞3次，并在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤。 对于 SEM，细胞通过梯度乙醇（30 至 100% v/v）脱水并风干。

对于免疫荧光染色，然后用 0.1% Triton X-100 在室温下透化细胞 15 分钟，并用 PBS 洗涤 3 次（每次 5 分钟）。 肌动蛋白丝用鬼笔环肽标记的四甲基罗丹明 (TRITC) 标记 40 分钟，细胞核用 DAPI 染色 5 分钟。 洗涤染色的细胞并用抗荧光冷却剂盖章。 使用尼康 A1R 共聚焦显微镜进行成像。

活死细胞染色

使用 Hoechst 33258 和碘化丙啶测定法进行活死细胞染色。 简而言之，细胞以 1×10 的密度在样品上培养。⁶ 每孔细胞。 Hoechst 33258、碘化丙啶和钙 AM 在 PBS 中分别稀释至 10 μg/ml 的最终浓度。 1天后，向每个样品中加入100μl混合溶液，细胞在37℃染色10分钟。